施一公组首次报道人源剪切体原子分辨率结构

医谷 2020-08-27 16:27:08

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2017年5月12日,清华大学生命学院、结构生物学高精尖创新中心施一公研究组于《细胞》(Cell)在线发表了题为《人源剪接体的原子分辨率结构》(An Atomic Structure of the Human Spliceosome)。这是第一个高分辨率的人源剪接体结构,也是首次在近原子分辨率的尺度上观察到酵母以外的、来自高等生物的剪接体的结构,进一步揭示了剪接体的组装和工作机理,为理解高等生物的 RNA 剪接过程提供了重要基础。


在真核生物细胞内,大多数基因是不连续的,它们的编码区(exon)被称为“内含子(intron)”的非编码序列隔断。在基因表达过程中,内含子需要经过“剪”和“接”这两步化学反应被去除,从而使得编码区可以连接成不同的信使 RNA(mRNA)。同一个基因,因为内含子的边界和数量不同,经过剪接,便可以产生出多种编码蛋白的 mRNA。RNA 剪接是所有真核生物特有的过程,是真核生物“中心法则”的关键步骤之一,也被认为是真核生物复杂性的重要分子基础。RNA 剪接过程必须高度精准,任何错误都有可能导致基因表达异常乃至疾病的发生。据统计,1/ 3 以上的遗传性疾病与 RNA 剪接异常有关。


RNA 剪接这一复杂的生理过程由剪接体(spliceosome)来执行。剪接体是细胞中已知的最为复杂的大分子机器,分子量巨大并且高度动态,主要由蛋白质 - 核酸形成的复合物(ribonucleoprotein,RNP)组装形成,它在前体信使 RNA(pre-mRNA)上完成识别、组装、激活、催化等一系列过程,并最终在反应结束后解离成许多小的功能单元,以进入下一个反应循环。根据剪接体的组成与构象的不同,可以将剪接体分为 E、A、B、Bact、B*、C、C*、P、ILS 等若干状态(图 1)。


图 1. 剪接反应过程示意图 (图片修改自 Janine,2012)


解析剪接体的高分辨率结构对于理解剪接反应的机理至关重要。2015 年 8 月,施一公课题组在世界上率先解析了酵母剪接体的高分辨率结构,在 2016 年又陆续报道了酵母剪接体在不同工作状态下的高分辨结构,提供了迄今为止最为全面和清晰的剪接体结构信息,揭示了 RNA 剪接的分子基础,极大地推动了这一领域的发展。


然而与酵母剪接体相比,以人类为代表的高等生物的剪接体组成、组装和调控更为复杂,其结构研究也因为组成的复杂性和构象的不稳定性而进展缓慢。由于超过 1 / 3 的人类遗传病与剪接过程中的错误直接相关,解析人源剪接体的结构不仅能帮助理解剪接反应的化学本质,更能促进对一些疾病发病机制的理解,并为研发针对剪接体的相关药物提供可能。因此人源剪接体的结构解析是极其重要并亟需解决的难题。


在最新发表的《细胞》研究长文中,施一公研究组利用修饰过的 pre-mRNA,在体外进行人源剪接体的组装,把剪接反应锁定在了第一步反应之后与第二步反应之前的状态,即 C * 状态。由于人源剪接体非常不稳定,研究人员使用化学交联剂在温和的条件下对剪接体进行固定,成功获得了稳定的人源剪接体样品,并采用单颗粒冷冻电镜重构出了 3.8 埃的近原子分辨率结构(图 2 和图 3)。


图 2. 人源剪接体的结构示意图


图 3. 人源剪接体与酵母剪接体的比较


在该结构中,剪接体核心区分辨率高达 3.0-3.5 埃,清晰地展示了由 20 余个蛋白与 RNA 组成的催化反应中心的结构(图 4 )。同时,他们观察到与第二步反应密切相关的剪接因子所呈现出的特定构象,对于稳定反应活性中心以及催化第二步转酯反应至关重要。该结构的解析为揭示第二步反应过程中剪接体的构象变化以及 3 剪接位点的识别提供了重要的结构依据。


图 4 人源剪接体的催化中心与调控机制


施一公教授为本文通讯作者; PTN 项目 15 级博士生张晓峰、结构生物学高精尖创新中心卓越学者闫创业、医学院博士生杭婧为本文共同第一作者,闫创业博士同时为本文共同通讯作者;生命学院博士后 Lorenzo I. Finci 参与了这项研究;清华大学冷冻电镜平台主管雷建林研究员协助数据收集,平台工作人员李晓梅、李晓敏在数据收集过程中提供了帮助;本课题得到了清华大学冷冻电镜平台,高性能计算平台、国家蛋白质设施实验技术中心(北京)的大力支持;本工作主要获得北京市结构生物学高精尖创新中心的经费支持,并获得了国家自然科学基金委以及科技部的资助。


文 | 清华大学结构生物学高精尖创新中心


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